第二章　制药制备技术

药物大多数属于结构确定、成分单一的有机化合物。制药过程中存在如何从各种液体或固体混合物中得到纯净的目标化合物的问题。混合物中各种化合物存在着种类和化学性质上的差异，利用这种差异性，我们可以从混合物中提取所需要的有机化合物，再经过分离、纯化及干燥，得到某个有机化合物。

第一节　制药提取技术

有机化合物的提取、分离、纯化及干燥是最基本的实验操作技术，其中提取是最基础的技术。提取收集和预处理的方法选择，是影响整个提取分离的关键。因此，了解并掌握有机化合物的提取和收集等方法十分重要。

一、经典提取技术

（一）溶剂提取法

1.溶剂提取法的原理

溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大、对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。其基本原理是利用有机化合物在溶剂中的可溶性及溶解性的差异。当溶剂加到中草药原料（需适当粉碎）中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分基本完全溶出或大部分溶出。

2.影响提取效果的因素

中草药成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大，亲于水而疏于油；有的结构中亲水性基团少，其极性小，亲脂性大而疏于水。这种亲水性、亲脂性及其程度的大小，是和化合物的分子结构直接相关的。一般来说，两种基本母核相同的成分，其分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性大，亲水性强，而亲脂性就越弱；其分子非极性部分越大，或碳链越长，则极性小，亲脂性强，而亲水性就越弱。

各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关。例如甲醇、乙醇是亲水性比较强的溶剂，它们的分子比较小，有羟基存在，与水的结构很近似，所以能够和水任意混合。丁醇和戊醇分子中虽都有羟基，保持了和水的相似处，但分子更大，与水的性质也就相差较大。所以它们能彼此部分互溶，在它们互溶达到饱和状态之后，丁醇或戊醇都能与水分层。氯仿、苯和石油醚是烃类或氯烃衍生物，分子中没有氧，属于亲脂性强的溶剂。

总的说来，只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂提取所需要成分的依据之一。

溶剂提取法的关键在于选择合适的溶剂和方法，但是在提取过程中药材的粉碎度、提取温度和时间等都能影响提取效率。

（1）粉碎度　溶剂提取过程包括渗透、溶解、扩散等过程，药材粉末越细，药粉颗粒表面积越大，上述过程进行得越快，提取效率就越高。但粉碎过细，表面积太大，吸附作用增强，反而影响扩散作用。另外，含蛋白质、多糖类成分较多的药材用水提取时，药材粉碎过细，虽有利于有效成分的提取，但蛋白质和多糖等这类杂质也溶出较多，使提取液黏稠，过滤困难，影响有效成分的提取和进一步分离，因此通常用水提取时可采用粗粉或薄片，用有机溶剂提取时可以略细，以能通过20目筛为宜。

（2）温度　温度增高，分子运动加快，溶解、扩散速度也加快，有利于有效成分的提出，所以热提常比冷提效率高。但温度过高，有些成分会被破坏，同时杂质溶出增多。故一般加热不超过60℃，最高不超过100℃。

（3）时间　有效成分的提出率随提取时间的延长而增加，直到药材细胞内外有效成分的浓度达到平衡为止。所以不必无限制地延长提取时间，一般用水加热提取以每次0.5～1h为宜，用乙醇加热提取每次以1h为宜。

3.溶剂的选择

运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①所选溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；②所选溶剂不能与中药的成分起化学变化；③所选溶剂要经济、易得、使用安全等。

常见的提取溶剂可分为以下3类：

（1）水　水是一种强的极性溶剂。中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及苷类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。酸水提取，可使生物碱与酸生成盐类而溶出，碱水提取可使有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分溶出。某些含果胶、黏液质类成分的中草药，其水提取液常常很难过滤。沸水提取时，中草药中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难。故含淀粉量多的中草药，不宜磨成细粉后加水煎煮。中药传统用的汤剂，多用中药饮片直火煎煮，加热除可以增大中药成分的溶解度外，还可能与其他成分产生“助溶”现象，增加了一些水中溶解度小的、亲脂性强的成分的溶解度。但多数亲脂性成分在沸水中的溶解度是不大的，即使有助溶现象存在，也不容易提取完全。如果应用大量水煎煮，就会增加蒸发浓缩时的困难，且会溶出大量杂质，给进一步分离提纯带来困难。

（2）亲水性的有机溶剂　也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮等，其中以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、黏液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取，溶剂量小，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低（64℃），但有毒性，使用时应注意。

（3）亲脂性的有机溶剂　也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃（氯仿除外），一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此大量提取中草药原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。

4.溶剂提取方法

用溶剂法提取常采用浸渍、渗漉、煎煮、回流提取及连续提取等操作方法。

（1）浸渍　将药材的粗粉或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂（一般用水或稀醇），以浸没药料稍过量为度，时常振动或搅拌，放置一段时间，滤出提取液，药渣另加新溶剂再浸渍。如此数次，合并提取液，浓缩即得提取物。本法简单易行，但提取效率差，提取时间长，用水浸渍时，必要时应加适量防腐剂以防霉变。

（2）渗漉　渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，形成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗漉过程中随时从药面上方补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止，或当渗漉液颜色极浅时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀渗漉液作为另一批新原料的溶剂之用。渗漉提取比浸渍法提取效率高，但溶剂消耗量大。

（3）煎煮　将药材粉末或薄片加水加热煮沸而提取有效成分的方法。操作时将药材粉末或薄片装入适宜的容器中，加水浸没药粉，充分浸泡后，用直火或蒸汽加热至沸，保持微沸一定时间，滤出煎出液，药渣依法再煎煮数次，合并各次煎出液，过滤浓缩后即得提取物。此法简单但杂质溶出较多，且不宜用于含挥发性成分及有效成分遇热易破坏药材的提取。

（4）回流提取　使用有机溶剂加热提取时，需采用加热回流装置，以免溶剂挥发损失。大量提取时，一般使用有蒸汽加热隔层的提取罐。此法提取效率较冷浸法高，但溶剂消耗仍较大，且含受热易被破坏的成分的药材不宜用此法。

（5）连续提取　为了改进回流提取法中需要溶剂量大的缺点，可采用连续提取法。实验室常用的连续提取装置为索氏提取器。该法所需溶剂量较少，提取也较完全，但提取成分受热时间长、遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。此外，应用索氏提取器来提取时，所用的溶剂的沸点也不能过高。提取终点的判定：用溶剂提取法时，为了尽可能将有效成分提取完全，常要对提取终点进行判定。常用方法是：若有效成分未知，可取最后的提取液数毫升于蒸发皿中，挥干溶剂，不留残渣即为提取终点；若有效成分已知，可选用该有效成分的定性反应来判断，至提取液反应呈阴性或微弱的反应阳性时即为提取终点。

（二）水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏法只适用于与水互不相溶且不被破坏的挥发性成分的提取，主要用于挥发油的提取。这类成分沸点在100℃以上，与水不相混溶或微溶，且在约100℃时有一定蒸气压，当与水一起加热时，其蒸气压和水的蒸气压总和为101.3kPa时，水蒸气将挥发性成分一并带出。馏出液往往分出油水两层，将油层分出即得挥发性成分，如馏出液不分层，则将馏出液经盐析法并用低沸点溶剂（常用乙醚）将挥发性成分萃取出来，回收溶剂即得。该法除用于挥发油的提取外，也可用于某些小分子生物碱如麻黄碱、槟榔碱和某些小分子的酚性物如牡丹酚等的提取。在水蒸气蒸馏前，应先加少量水使药材粉末充分润湿后再进行操作，这将有利于挥发性成分的蒸出。

（三）升华法

某些固体化学成分受热直接变成气态，遇冷后又凝固为固体的性质称为升华。升华既可以分离挥发度不同的固体混合物，也可以除去难挥发的杂质。天然药物中有些化学成分具有升华的性质，就能利用升华的方法将这些成分直接从药材粉末中提取出来。此法简单易行，但具有升华性的化学成分较少，仅见于少数单萜类、生物碱、游离羟基蒽醌、香豆素和有机酸类成分。茶叶中的咖啡碱在178℃以上就能升华而不被分解。游离羟基蒽醌类成分、一些香豆素类、有机酸类成分，有些也具有升华的性质，例如七叶内酯及苯甲酸等。

升华法虽然简单易行，但中草药炭化后，往往产生挥发性的焦油状物，黏附在升华物上，不易精制除去。另外，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。

二、现代提取技术

（一）超临界流体萃取技术

超临界流体萃取是一项发展很快、应用很广的实用性新技术，超临界是指高于临界压力和临界温度时的一种状态。传统的提取物质中有效成分的方法，如水蒸气蒸馏法、减压蒸馏法、溶剂萃取法等，其工艺复杂、产品纯度不高，而且易残留有害物质。超临界流体萃取是利用流体在超临界状态时具有密度大、黏度小、扩散系数大等优良的传质特性而成功开发的。它具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点。

1.超临界流体萃取的原理

超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和相对分子质量大小不同的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界流体萃取过程是由萃取和分离组合而成的。

用于提取有机挥发物的超临界流体，一般是二氧化碳，二氧化碳在7.38MPa和31℃条件下成为超流体。使用过程中，将二氧化碳超流体通过样品，样品中的挥发性有机化合物随二氧化碳超流体一同流出。超临界流体是有机挥发物提取的好方法，但需要使用超流体提取设备，操作复杂，成本较高。

2.影响超临界萃取的主要因素

（1）密度　溶剂强度与超临界流体的密度有关。温度一定时，密度（压力）增加，可使溶剂强度增加，溶质的溶解度增加。

（2）夹带剂　适于作为超临界流体的大多数溶剂是极性小的溶剂，这有利于选择性提取，但限制了其对极性较大溶质的应用。因此可在这些超临界流体中加入少量夹带剂（如乙醇等），以改变溶剂的极性。

（3）粒度　溶质从样品颗粒中的扩散，可用Fick第二定律加以描述。粒子的大小可影响萃取的收率。一般来说，粒度小有利于二氧化碳超流体萃取。

（4）流体体积　提取物的分子结构与所需的超临界流体的体积有关。增大流体的体积能提高回收率。

（二）超声波提取技术

超声波提取技术（ultrasound extraction，UE）是近年来应用于中草药有效成分提取分离的一种最新的较为成熟的手段。超声波是指频率为20～50MHz左右的电磁波，它是一种机械波，需要能量载体——介质来进行传播。超声波在传递过程中存在着正负压强交变周期，在正相位时，对介质分子产生挤压，介质密度增加；负相位时，介质分子稀疏、离散，介质密度减小。也就是说，超声波并不能使样品内的分子产生极化，而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。

1.超声波萃取的原理

超声波萃取中药材的优越性，是基于超声波的特殊物理性质。主要是通过电压换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品成分之间的作用力，从而实现固-液萃取分离。①超声波能够加速介质质点运动，将超声波能量作用于药材中药效成分质点上，使之获得巨大的加速度和动能，迅速逸出药材成分而游离于水中。②超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，使中药材成分逸出，并使得药材成分被不断分离，其中不属于植物结构的药效成分不断被分离出来，加速植物有效成分的浸出提取。③超声波的振动匀化，使整个样品萃取更均匀。

另外，超声波的热作用也能促进超声波强化萃取，超声波在媒质质点传播过程中，能量不断被媒质质点吸收转变成热能，导致媒质质点温度升高，促进有效成分的溶解。

综上所述，天然药物中的药效物质在超声波场作用下不但作为介质质点获得自身的巨大加速度和动能，而且通过“空化效应”获得强大的外力冲击，所以能高效率并充分分离出来。

2.超声波萃取的特点

适用于中药材有效成分的萃取，是中药制药彻底改变传统的水煮醇沉萃取方法的新方法、新工艺。与水煮醇沉工艺相比，超声波萃取具有如下突出特点：

①无需高温。在40～50℃水温下超声波强化萃取，无水煮高温，不破坏中药材中某些具有热不稳定、易水解或氧化特性的药效成分。超声波能促使植物细胞破壁，提高中药的疗效。

②常压萃取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便。

③萃取效率高。超声波强化萃取20～40min即可获最佳提取率，萃取时间仅为水煮醇沉法的1/3或更少。萃取充分，萃取量是传统方法的2倍以上。据统计，超声波在65～70℃工作效率非常高。而温度在65℃内中草药植物的有效成分基本没有受到破坏。加入超声波后（在65℃条件下），植物有效成分提取时间约40min；而蒸煮法的蒸煮时间往往需要2～3h，是超声波提取时间的3倍以上。每罐提取3次，基本上可提取有效成分的90％以上。

④具有广谱性。适用性广，绝大多数的中药材各类成分均可超声萃取。

⑤超声波萃取的溶剂和目标萃取物的性质（如极性）关系不大。因此，可供选择的萃取溶剂种类多，目标萃取物范围广泛。

⑥减少能耗。由于超声萃取无需加热或加热温度低，萃取时间短，因此大大降低能耗。

⑦药材原料处理量大，成倍或数倍提高，且杂质少，有效成分易于分离、净化。

⑧萃取工艺成本低，综合经济效益显著。

⑨超声波具有一定的杀菌作用，保证萃取液不易变质。

（三）微波提取技术

微波提取（microwave extraction，MAE）是根据不同物质吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取剂中，从而达到提取的目的。

1.微波提取的原理

微波是一种频率在300MHz～300GHz之间的电磁波，它具有波动性、高频性、热特性和非热特性四大基本特性。常用的微波频率为2450MHz。微波加热是利用被加热物质的极性分子（如H2O、CH2Cl2等）在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦而发热。微波加热是能量直接作用于被加热物质，空气及容器对微波基本上不吸收和反射，保证了能量的快速传递和充分利用。

2.微波提取的特点

①体现在微波的选择性，因其对极性分子的选择性加热从而对其进行选择性溶出。

②微波提取大大缩短了提取时间，加快了提取速度，传统提取方法需要几小时至几十小时，超声提取也需0.5～1h，微波提取只需几秒到几分钟，提取速度提高了几十至几百倍，甚至几千倍。

③微波提取由于受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂较多，同时溶剂的用量较少。

微波提取一般适合于热稳定性的物质，对热敏感性物质，微波加热易导致变形或失活；要求物料有良好的吸水性，否则细胞难以吸收足够的微波将自身击破，产物也就难以释放出来；微波提取对组分的选择性差。

第二节　制药分离技术

提取到的有机物一般仍然是混合物，要得到单一的纯物质就必须再进行分离纯化过程。传统常规的有机化合物分离技术，如蒸馏、重结晶等，是最基本的分离技术，它们与现代的色谱分离技术相比具有简易、有效、成本低的特点，更适于工厂生产。

一、蒸馏技术

液态物质受热沸腾气化成蒸气，蒸气经冷凝又转变成液体，这一操作过程称为蒸馏。蒸馏是纯化分离液态物质的一种常用方法，通过蒸馏还可以测定纯液态物质的沸点。

蒸馏分离的基础：在一定的压力和温度下，不同的液态有机化合物具有不同的饱和蒸气压，或者说，在一定的压力下有不同的液态有机化合物，具有不同的沸点。

每一种液态有机化合物，在一定的压力下，都具有确定的沸点。不同的液态有机化合物，由于结构差异而致沸点不同。在一定的温度下，每种液态有机化合物都有不同的饱和蒸气压，液态有机化合物的蒸气压越高，越易挥发。不同挥发度的液体有机化合物混合后，当受热汽化时，易挥发组分易被汽化，即低沸点的有机化合物先被蒸出；而较难挥发组分不易被汽化，即较高沸点有机化合物不易被蒸出或后被蒸出。若蒸气一旦遇冷，低沸点的成分可能仍保持为气态，而高沸点的成分则会先被冷凝成液态，通过这样的气-液平衡，从混合液体中分离出挥发和半挥发性的有机化合物。

蒸馏方法一般可分为简单蒸馏、分馏和减压蒸馏3类。

1.简单蒸馏

简单蒸馏是一种最简易、常用的分离液体有机化合物的技术，适合于组分少，且各组分间沸点相差至少30℃的混合液体有机化合物的分离。

简单蒸馏装置由蒸馏瓶、蒸馏头、温度计、冷凝管和接受器等组成，对于高沸点微量有机化合物的蒸馏可不用冷凝管。

简单蒸馏注意事项如下：

①简单蒸馏在常压下操作，装置必须与大气相通，以免发生爆炸；不得用明火加热。

②蒸馏瓶选择，一般液体体积约占蒸馏瓶体积的1/3～2/3为宜。

③简单蒸馏过程中，注意观察温度的变化，收集不同馏分。

④蒸馏速度，一般控制以馏出组分1滴/s为宜。

⑤馏出蒸气的冷凝，一般是用水经直形冷凝管进行。对于非常易挥发的成分，可采用冰-水浴等加强冷凝效果；对于高沸点的蒸气（一般130℃以上），则需要用空气冷凝管或将蒸气直接通入接受器，此时千万不能通水冷凝，否则会使冷凝管内外温差大而爆裂。

2.分馏（精馏）

简单蒸馏只适宜对沸点相差大且组分少的有机液体混合物的分离。分离多种组分沸点相差20℃以下的有机液体混合物，必须采用分馏或精馏的方法。

分馏是将许多次的简单蒸馏整合，在简单蒸馏系统中加入分离柱即可。

现在多种高效的分离柱，根据待分馏样品性质、数量和沸点差异，选择合适尺寸和填充材料的分离柱。一个高效的分离柱，可以分馏沸点相差0.5℃的有机混合液体。

进行分馏操作时，一般需要注意以下问题：

（1）分馏柱的选择　一般沸点相差30℃以上可不必用分馏柱；相差20℃左右选择简单分馏柱；相差10℃左右选择精细分馏柱；而沸点相差10℃以下时，必须使用复杂精细的分馏柱。

（2）分馏柱柱高　柱高是影响分馏效率的重要因素之一，要合理选择。

（3）分馏柱装填　不宜太紧或不均匀，且应注意柱的保温，以免发生“液泛”现象。

（4）分馏柱内的温度梯度　一般通过调节馏出组分速度来控制，若馏出速度太快，柱内温度梯度减小，达不到好的分离效果；若馏出速度太慢，柱内冷凝液体则会聚集产生“液泛”现象。

采用分馏技术可以有效地分离各种混合液体有机物，甚至可以分离沸点相差1～2℃的混合物。但是，与简单蒸馏一样，分馏操作也不能分离共沸混合物。

3.减压蒸馏

在减压条件下进行蒸馏即减压蒸馏，它适用于高温易氧化变性和局部炭化的有机混合物分离。许多液体有机化合物的分离都采用减压蒸馏的方法，通常减压蒸馏系统包括蒸馏装置、缓冲瓶、测压装置、气体吸收装置。

减压蒸馏系统中真空泵常分为水泵、油泵和扩散泵三类：水泵真空度最低，在1～4.2kPa（5～30℃）；油泵真空度次之，真空度在15～1300Pa；扩散泵以泵为介质，真空度可达1～10Pa。当有低沸点有机化合物进入泵内，将难以达到所需真空度。一般先在水泵减压下旋转蒸发除去低沸点组分，然后使用油泵减压蒸馏，再使用扩散泵减压蒸馏。

4.沸点测定

沸点指液体化合物在101.325kPa压力下沸腾的温度。纯净的有机化合物的沸程应该在±2℃范围。蒸馏方法分离得到的液体有机化合物，可通过测定沸点确定纯度。

液体有机化合物的沸点测定有常量法和微量法。常量法采用的是蒸馏装置，方法与简单蒸馏操作相同，而微量法所使用的装置与熔点测定装置相同。

二、结晶和沉淀法

（一）结晶与重结晶

大多数药物都是结晶态的有机化合物，结晶态的有机化合物具有一定的熔点、溶解度和结晶学特征。结晶是指从液态或非固态有机混合物中产生并得到结晶态有机化合物的过程；重结晶是指低纯度固态有机化合物重复结晶得到高纯度结晶态有机化合物的过程。结晶和重结晶是两个不同的结晶过程。结晶与重结晶的结果与使用的溶剂、温度和搅拌等因素有关。结晶和重结晶是固体有机化合物最常用的分离和纯化方法。

1.原理

一般而言，固体有机化合物在溶剂中的溶解度随温度变化而变化。温度升高，溶解度增大；温度降低，溶解度降低，只有少数例外。

2.实验方法

（1）溶剂的选择　结晶或重结晶方法的关键是选择有效的溶剂。结晶和重结晶操作前，先预试验选定结晶溶剂。

在加热条件下，使用1～4mL就能溶解100mg样品，并能在冷却下结晶析出的溶剂，可以被选作结晶溶剂。

溶剂的选择应注意的问题：

①溶剂的化学惰性。所选溶剂应不与固体有机化合物发生化学反应，尤其在加热条件下。

②溶剂的沸点不宜太高，以便于结晶后去除溶剂。

③所选溶剂中被结晶物和杂质溶解度要有差异。

④混合溶剂的使用。若用单一的溶剂难以满足要求时，可使用混合溶剂。混合溶剂一般由两种溶剂组成，一种溶剂对固体有机化合物有很好的溶解性能，另一种则溶解性小，而且两种溶剂必须是可以任意混合的。

（2）实验操作

①常量重结晶　对于1g以上的固体样品纯化，一般采用常量重结晶。对于少量固体样品的纯化，则需采用微量操作。但溶解样品及脱色过程是它们的共同点。

a.溶解样品。

b.脱色。

c.热溶液的过滤。

d.滤液中结晶的析出。低纯度或低熔点的固体有机化合物，往往难以结晶得到高纯度结晶产物，尤其是低熔点且低纯度的。遇到难以结晶的有机化合物，除采取低温和延长时间外，可用玻璃棒蘸一些溶液放在空气中吹干溶剂析出微量固体，再将玻璃棒放回溶液或直接加入晶种；或摩擦容器内壁溶液边缘；或除去一些溶剂使溶液浓缩；或换其他溶剂重新结晶操作。对于低熔点有机化合物，最佳方法是先采用柱色谱分离纯化，再结晶。

e.结晶的分离和干燥。采用低沸点溶剂重结晶、对空气和湿气相对稳定的产品，可在空气中自然干燥；对空气和温度相对稳定的产品，可在红外灯下烘箱中干燥；对湿气和温度不稳定的产品，可在真空烘箱中减压干燥；较好的干燥方法是在装有合适干燥剂（如氯化钙、浓硫酸、硅胶、氢氧化钠、五氧化二磷等）的普通或真空干燥器中进行。

f.混合溶剂重结晶。

②半微量重结晶　待纯化样品的量少于500mg时，采用普通布氏漏斗完成操作，产物损失比较大，应该采用特殊装置及程序进行半微量重结晶。

对于热不稳定的固体有机化合物重结晶操作，还可以在常温下溶解固体，然后放入低温冰箱或其他低温装置中，待析出固体时，趁冷过滤。需要注意的是：一些溶剂在低温时会冷凝，如水和甲苯就分别在0℃和-3℃凝固，不能选作低温重结晶的溶剂。只要选择了合适的溶剂和温度条件，重结晶操作就可以有效分离固体有机化合物。

（3）重结晶注意事项

①选择适当的溶剂。首先需根据待纯化样品的性质选择适当的溶剂。

②加热回流。一般需用回流装置。

③活性炭使用。活性炭在极性溶液中的脱色效果较好，用量尽量少，以免吸附纯化物质。

④热过滤操作前，应将漏斗及滤瓶事先充分预热；操作迅速，以防止晶体在漏斗上析出。

⑤冷却结晶。将热过滤滤液自然冷却结晶。

（二）沉淀法

在混合物溶液中，有机化合物和一些已知的试剂反应，形成固体沉淀而被分离的方法，称为沉淀法。

常用的沉淀试剂是醋酸铅。醋酸铅有中性和碱性两种，能与许多有机化合物形成铅盐沉淀。

中性醋酸铅能和有机酸、酸性皂苷、部分黄酮以及蛋白质、氨基酸、鞣质、树脂等酸性和酚类物质产生沉淀。

碱性醋酸铅，除了能沉淀中性醋酸铅沉淀的那些物质外，还能沉淀醇、酮、醛、异黄酮、部分生物碱和糖类有机化合物。

沉淀的有机化合物铅盐脱铅后，得到各种含有活性官能团的有机化合物。

醋酸铅沉淀法关键步骤是脱铅处理，常用硫化氢或硫酸、磷酸以及强酸性阳离子交换树脂等方法脱铅。

使用铅盐毒性较大，常用氢氧化铝或明矾等代替醋酸铅，铅盐的沉淀效果没有铅盐好。

（三）熔点测定

固体有机化合物纯度，可以通过测定有机化合物的熔点和熔距来判断。纯的有机化合物具有确定的熔点，且熔距不超过0.5～1℃。低纯度化合物及具有相同熔点的固体有机混合物，熔距较长。根据固体有机化合物的熔点和熔距可以判断化合物及其纯度。熔点是鉴定固体有机化合物的重要参数，也是固体有机化合物纯度的判断标准。

测定固体有机化合物熔点的常用方法有毛细管法和数字熔点仪法。

毛细管法是将固体有机化合物装入单口的毛细管中，样品高约4mm，要装得紧密均匀，用细橡皮圈将毛细管固定在温度计上，毛细管装样部位位于温度计水银球处，b形管注入导热液，使导热液液面位于b形管交叉口处，使温度计的水银球位于b形管两支管的中间，慢慢加热测定熔点。

使用毛细管法测定熔点注意事项：

（1）样品干燥　待测样品必须充分干燥，有水分存在会致熔点降低、熔距变宽。

（2）样品处理　待测样品需充分研细，装样要紧密均匀，否则影响熔距变宽。

（3）加热　b形管加热时可先快速，接近熔点时必须缓慢加热。对于未知熔点固体有机化合物一般需要先粗测一次熔点，确定熔点的温度范围，然后再精测。

（4）观察　如果观察到毛细管中固体有机化合物产生色变、升华和炭化等现象，则不能使用熔点测定。

（5）复测　熔点测定必须进行复测，每次要使用新装样样品熔点毛细管。

三、膜分离技术

膜分离技术是近年来发展较快的有机化合物分离方法，可以分离气态有机化合物、液态有机化合物和某些固态有机化合物，操作简单且无需或只需要很少溶剂。

膜分离技术的基本原理是利用膜的孔径大小使分子大小不同的有机化合物分离开来。可以分离液态、固态和气态各种有机化合物。尤其是对气态有机化合物的分离，膜分离技术已经非常成熟，应用广泛。如聚硅氧烷膜调节气体出入就可以使食物保鲜和粮食储存很长时间。

透析法是经典的膜分离技术之一。利用半透膜能使小分子物质通过而大分子物质不能通过的原理，使分子大小不同的有机化合物得到分离。操作时将样品加入有半透膜内衬的透析袋中，然后将透析袋放入清水或稀醇溶剂中，小分子有机化合物将从透析袋透析到水或稀醇中，大分子有机化合物保留在透析袋中。

电透析法适用于能离子化的有机化合物，在半透膜透析袋两旁放置电极，接通电路，透析袋中带负电荷的分子如有机酸等向阳极移动，带正电荷的分子如生物碱等向阴极移动，而中性有机化合物和不能透析的大分子则仍存留在透析袋中，电透析法使透析速度增加数十倍。

膜分离技术的关键是制膜材料。目前的材料是有机硅和有机氟高分子聚合物，即硅膜（聚甲基硅氧烷及其改性高分子聚合物）和氟膜（聚四氟乙烯及改性聚合物），它们可以对脂肪烃、芳香烃、卤代烃、含氟有机化合物（含氨基、硝基和氰基等）、羟基有机化合物（醛、酮等）、酚和醇、杂环以及醚和酯等各类有机化合物进行分离和浓缩。

膜分离分为非选择性分离和选择性分离两种类型。

非选择性分离类型，即膜材料与有机化合物分子不发生作用，根据膜孔径的大小分离有机化合物，比如经典透析法，基本属于此种类型。

选择性分离类型不仅根据膜的孔径大小，而且还根据膜材料对不同有机化合物具有特异选择性作用而分离有机化合物，如硅膜对许多极性有机化合物和苯系列物质有选择分离作用，而氟膜对中性不易挥发的有机化合物具有选择分离作用。

膜分离技术装置一般根据分离对象的状态及特性自行组装。现在制膜工艺和分离技术发展迅速，性能优异的新膜材料不断出现，适应对各类有机化合物的分离；还可以将孔径不同和具有特异选择性的各种膜合理地串联使用，从而提高分离效果；分离膜探针对生物体中的有机化合物进行分离；膜分离技术与各类色谱和质谱联用，可实现有机化合物提取分离和结构鉴定一体化。

综上所述，膜分离技术是一种非常好的有机化合物分离技术，将会极大地改善有机化合物的分离和纯化。

第三节　制药色谱分离技术

色谱法，过去又称层析法。

一、色谱原理

色谱分离原理是使被分离物中各组分在固定相和流动相两相间进行分配。

根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱或凝胶色谱等方法。

（一）吸附色谱

吸附色谱法是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分得到分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。液-固吸附色谱是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等相对分子质量的样品（相对分子质量小于1000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分，一般不适用于相对分子质量较高的样品如蛋白质、多糖或离子型亲水性化合物等的分离。

吸附色谱的分离效果，取决于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。

1.吸附剂

常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。

（1）硅胶　色谱用硅胶为多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交联结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17％，吸附力极弱，不能用作为吸附剂，但可作为分配色谱中的支持剂。一般用硅胶作为吸附剂时，先要对硅胶进行活化，将硅胶加热至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去，从而实现活化。当温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩合转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活性，就不再有吸附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度下进行（一般在170℃以上即有少量结合水失去）。硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的色谱。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。

（2）氧化铝　氧化铝可能带有碱性，对于分离一些碱性天然药物成分，如生物碱类的分离比较理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、酸、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生反应，如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中弱碱性杂质可用水洗至中性，称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有或Cl-阴离子，从而具有离子交换剂的性质，适合于酸性成分的色谱分离，这种氧化铝称为酸性氧化铝。供色谱分离用的氧化铝，其粒度要求在100～160目之间。粒度大于160目，分离效果差；小于100目，溶剂流速太慢，易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比，一般在1:（20～50）之间，色谱柱的内径与柱长比例在1:（10～20）之间。在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每0.5～1h内流出液体的体积（mL）与所用吸附剂的质量（g）相等为合适。

（3）活性炭　是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥后即可供色谱用。色谱用的活性炭，最好选用颗粒活性炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些苷。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则相对较弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。

2.溶剂

色谱过程中溶剂的选择，对组分分离影响极大。在柱色谱时所用的溶剂（单一溶剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸色谱时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑。在用极性吸附剂进行色谱时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。

在柱色谱操作时，被分离样品在加样时可采用干法，也可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后逐渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在色谱柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过快，就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水性溶剂中所形成的吸附作用，比在脂溶性溶剂中要强。

3.被分离物质的性质

被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附色谱中的三个要素，彼此紧密相连。在指定吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附性强。

总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能被分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质、吸附剂的吸附强度、与溶剂的性质这三者的相互关系来综合考虑。首先要考虑被分离物质的极性，如被分离物质极性很小，或非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数天然药物成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层色谱以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。

以下介绍操作方法：

1.装柱

将色谱柱洗净、干燥。底部先放数颗用纱布包着的玻璃珠，再铺一层脱脂棉。装柱法有两种，即干装法和湿装法。

（1）干装法　将吸附剂通过漏斗倒入柱内，中间不应间断，形成一细流慢慢加入管内。也可用橡皮锤或洗耳球轻轻敲打色谱柱，或于下端抽真空，使装填均匀紧密。柱装好后，打开下端活塞，然后倒入洗脱剂，以排尽柱内空气，并保持一定的液面。

（2）湿装法　将最初准备使用的洗脱剂装入柱内，打开下端活塞，使洗脱剂缓慢流出。然后把吸附剂慢慢连续不断地倒入柱内（或将吸附剂与适量洗脱剂调成混悬液慢慢加入柱内），吸附剂依靠重力和洗脱剂的带动，在柱内自由沉降。此间要不断把流出的洗脱剂加回柱内，直至把吸附剂加完并在柱内沉降不再变动为止。然后在吸附剂上面加一小片滤纸或少许脱脂棉花。根据加样量控制洗脱剂液至一定高度。

2.加样

将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中，制成样品溶液，加于色谱柱中吸附剂面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂，则将样品溶于易挥发的溶剂中，并加入适量吸附剂（不超过柱中吸附剂全量的1/10）与其拌匀，除尽溶剂，将拌有样品的吸附剂均匀加到柱顶，再覆盖一层吸附剂或玻璃珠即可。

3.洗脱

（1）常压洗脱　是指色谱柱上端不密封，与大气相通。先打开柱下端活塞，保持洗脱剂流速1～2滴/s，等份收集洗脱液。上端不断添加洗脱剂（可用分液漏斗控制添加速度与下端流出速度相近）。如单一溶剂洗脱效果不好，可用混合溶剂洗（一般不超过三种溶剂），通常采用梯度洗脱。洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐渐递增。每份洗脱液采用薄层色谱或纸色谱定性检查，合并含相同成分的洗脱液。经浓缩、重结晶处理往往可得到某一单体成分。如仍为几个成分的混合物，不易析出单体成分的结晶，则需要进一步色谱分离或用其他方法分离。

（2）低压洗脱　是指色谱柱上配一装洗脱剂的色谱球，并将色谱球与氮气瓶相连通，在0.5～5kgf/cm2（1kgf/cm2=98.0665kPa）压力下洗脱。此法所用色谱柱为硬质玻璃柱。使用的吸附剂颗粒直径较小（200～300目），可用薄层色谱用的硅胶、氧化铝、细颗粒的聚酰胺、活性炭等。分离效果较经典柱色谱高。

（二）分配色谱

分配色谱是利用混合物中各成分在两种不相混溶的液体之间的分布情况不同，而进行分离的一种方法。相当于连续逆流萃取分离法，所不同的是把其中一种溶剂固定在某一固体物质上，这种固体物质只是用来固定溶剂，本身没有吸附能力，称为“支持剂”或“担体”，被支持剂吸着固定的溶剂称为固定相。用来冲洗柱子的溶剂称为流动相。在洗脱过程中，流动相流经支持剂时与固定相发生接触。由于样品中各成分在两相之间的分配系数不同，因而向下移动速度也不一样，易溶于流动相中的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动慢，从而得以分离。

1.支持剂的选择

作为分配色谱的支持剂应具备以下条件：①中性多孔粉末，无吸附作用，不溶于色谱时所用的溶剂系统中；②能吸着一定量的固定相，最好能达到支持相的50％以上，而流动相能自由通过，并不改变其组成。常用的支持剂有以下几种：

（1）含水硅胶　含水量在17％以上的硅胶已失去吸附作用，可作为分配色谱的支持剂。硅胶吸收本身重量50％的水仍呈不显潮湿的粉末状。

（2）硅藻土　作为分配色谱的支持剂很好，因为硅藻土可吸收其本身重量的100％的水，而仍呈粉末状，几无吸附性能，且装柱容易。

（3）纤维素　能吸收本身重100％的水，仍呈粉末状。

2.固定相的选择

如分离亲水性成分，用正相分配色谱。在正相分配色谱中，所用固定相一般为水、各种水溶液（如酸、碱、盐、缓冲液、甲醇、甲酰胺等）。如分离亲脂性成分，则用反相分配色谱。在反相分配色谱中，所用固定相多为亲脂性强的有机溶剂，如硅油、液体石蜡等。

3.流动相的选择

在正相分配色谱中，流动相常选用石油醚、环己烷、苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异戊醇等与水不相混溶（以很少混溶）的有机溶剂。洗脱时流动相的亲水性由弱到强逐渐增加。

在反相分配色谱中，流动相常选用水、甲醇、乙醇等。洗脱时流动相的亲水性由强至弱逐渐减小。

4.操作方法

（1）装柱　先将选好的固定相溶剂和支持剂放在烧杯内搅拌均匀，在布氏漏斗上抽滤，除去多余的固定相后，再倒入选好的流动相溶剂中，剧烈搅拌，使两相互相饱和平衡，然后在色谱柱中加入已用固定相溶剂饱和过的流动相，再将载有固定相的支持剂按吸附柱色谱湿装法装入柱中。

（2）加样　样品量与支持剂量比是1:（100～1000），加样量比吸附色谱少。方法是将样品溶于少量流动相中，加于柱的顶端。如样品难溶于流动相，易溶于固定相，则用少量固定相溶解后，须用少量支持剂，再装于柱顶。如样品在两相中溶解度均不大，则可溶于其他适宜的易挥发溶剂中，拌以干燥的支持剂，待溶剂挥尽后，按1:（0.5～1）（支持剂:固定相）的量加入固定相拌匀后上柱。

（3）洗脱　洗脱方法同吸附柱色谱法，但必须注意的是，用作流动相的溶剂一定要事先以固定相溶剂饱和，否则色谱过程中大量的流动相通过支持剂时，就会破坏平衡，其至最后只剩下支持剂，从而达不到分离的目的。

（三）离子交换色谱

离子交换色谱是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱色谱法。该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高、重复性、选择性好、分离速度快等优点，是当前最常用的色谱法之一，常用于多种离子型生物分子的分离，包括蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等。

离子交换色谱对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管中进行的。离子交换剂为人工合成的多聚物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。含有欲被分离的离子的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的带电部位竞争结合。离子通过柱时的移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。离子交换剂是由基质、荷电基团和反离子构成，在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。

离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应：

该反应能以极快的速度达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。

溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换，一般来说，电性越强，越易交换。对于阳离子树脂，在常温常压的稀溶液中，交换量随交换剂离子的电价增大而增大。例如：

Na+<Ca2+<Al3+<Si4+

若原子价数相同，交换量则随交换离子的原子序数的增大而增大。例如：

Li+<Na+<K+<Pb+

在稀溶液中，强碱性树脂各负电性基团的离子结合力次序是：

CH3COO-<F-<OH-<HCOO-<Cl-<SCN-<Br-<<<I-<<<柠檬酸根

弱酸性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为：

F-<Cl-<Br-<I-<CH3COO-<<<<<酒石酸根<柠檬酸根<<<OH-

两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和特定的条件呈现的离子状态：当pH<pI时，能被阳离子交换剂吸附；反之，当pH>pI时，能被阴离子交换剂吸附。

若在相同pI条件下，且pI>pH时，pI越高，碱性就越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。

选择离子交换剂的一般原则如下：

①选择阴离子或阳离子交换剂，取决于被分离物质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。

②强型离子交换剂使用的pH范围很广，所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。

③离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择H+型和OH-型；弱酸型和弱碱型离子交换剂应分别选择Na+型和Cl-型。

④交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质有不同的作用性质，因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易被破坏。

（四）排阻色谱或凝胶色谱

排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质相对分子质量大小的不同和在填料上渗透程度的不同来进行分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。该法设备简单，操作方便，重复性好。

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的色谱柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出色谱柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出色谱柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。如果两种以上不同相对分子质量的分子都能进入凝胶颗粒网孔，但由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此也可以分离开来。

常用的凝胶类型有：交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。

二、色谱分离方法

色谱法的分离方法有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不发生化学反应，一般选用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，均系指在室温下操作。

分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245～365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定；也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出；还可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。柱色谱法所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装有吸附剂。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果。除另有规定外，通常多采用直径为0.07～0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响，应当注意。

（1）吸附剂的填装

①干法　将吸附剂一次性加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始色谱时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。

②湿法　将吸附剂与流动相混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整。填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下，液面将与柱表面相平时，即加试样溶液。

（2）试样的加入　除另有规定外，将试样溶于色谱时使用的流动相中，再沿色谱管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起；或将试样溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

（3）洗脱　除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品种和比例，分别分部收集洗脱液，至洗脱液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。

（一）纸色谱法

以纸为载体，用单一溶剂或混合溶剂进行分配。亦即以纸上所含水分或其他物质为固定相，用流动相进行展开的分配色谱法。

所用滤纸应质地均匀平整，具有一定的机械强度，必须不含会影响色谱效果的杂质，也不应与所用显色剂起作用，以免影响分离和鉴别效果，必要时可作特殊处理后再用。试样经色谱后可用比移值（Rf）表示各组成成分的位置（比移值=原点中心至色谱斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离之比），由于影响比移值的因素较多，因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。作为单体鉴别时，试样所显主色谱斑点的颜色（或荧光）与位置，应与对照（标准）样所显主色谱的斑点或供试品-对照品（1:1）混合所显的主色谱斑点相同。进行质量指标（纯度）检查时，可取一定量的试样，经展开后，按各单体的规定，检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色（或荧光）的强度。进行含量测定时，可将色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定，也可用色谱扫描仪测定。

色谱可以向一个方向进行，即单向色谱；也可进行双向色谱，即先向一个方向展开，取出，等流动相完全挥发后，将滤纸转90°，再用原流动相或另一种流动相进行展开，亦可多次展开。

（二）薄层色谱法

薄层色谱是一种简便、快速、微量的色谱方法。一般将柱色谱用的吸附剂撒布到玻璃片上，形成一薄层进行色谱时，即称薄层色谱，其原理与柱色谱基本相似。

1.薄层色谱的特点

薄层色谱在应用与操作方面的特点与柱色谱的比较相似。

2.吸附剂的选择

薄层色谱用的吸附剂选择原则和柱色谱相同。主要区别在于薄层色谱要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层色谱的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10cm，否则可引起色谱扩散，影响分离效果。

3.展开剂的选择

薄层色谱，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ级或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。天然药物化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。但在实际工作中，经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整。

4.特殊薄层

针对某些性质特殊的化合物的分离与检出，有时需采用一些特殊薄层。

（1）荧光薄层　有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适当的显色剂时，则可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行色谱。展层后置于紫外光下照射，薄层板本身显荧光，而样品斑点处不显荧光，即可检出样品的色谱位置。

常用的荧光物质多为无机物。其一是在254nm紫外光激发下显出荧光的，如锰激化的硅酸锌；另一种为在365nm紫外光激发下发出荧光的，如银激化的硫化锌。

（2）络合薄层　常用的有硝酸银薄层，用来分离碳原子数相等而其中碳碳双键数目不等的一系列化合物，如不饱和醇、酸等。其主要机理是由于碳碳双键能与硝酸银形成络合物，而饱和的碳碳键则不与硝酸银络合。因此在硝酸银薄层上，化合物可由于饱和程度不同而获得分离。色谱时饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一个双键的较含两个双键的Rf值高，含一个叁键的较含一个双键的Rf值高。此外，在一个双键化合物中，顺式的构型与硝酸银络合较反式的易于进行。因此，还可用来分离顺反异构体。

（3）酸碱薄层和pH缓冲薄层　为了改变吸附剂原来的酸碱性，可在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层。例如硅胶带微酸性，有时对碱性物质如生物碱的分离不好，如不能展层或拖尾，则可在铺薄层时，用稀碱溶液（0.1～0.5mol/L NaOH溶液）制成碱性硅胶薄层。

5.应用

薄层色谱法在中草药化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。用薄层色谱法进行中草药化学成分预试，可依据各类成分性质及已知的条件，有针对性地进行。由于在薄层上展层后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠。

以薄层色谱法进中草药化学成分鉴定，最好要有标准样品进行对照。如用数种溶剂展层后，标准品和鉴定品的Rf值、斑点形状、颜色都完全相同，则可得到初步结论是同一化合物。但一般需采用一种仪器分析方法如化学反应或红外光谱等加以核对。

用薄层色谱法探索柱色谱分离条件，是实验室的常规方法。在进行柱色谱分离时，首先考虑选用何种吸附剂与洗脱剂。在洗脱过程中各个成分将按何种顺序被洗脱，每一洗脱液中是否为单一成分或混合体，均可由薄层的分离得到判断与检验。通过薄层的预分离，还可以了解多组分样品的组成与相对含量。如在薄层上摸索到比较满意的分离条件，即可将此条件用于柱色谱。但亦可以将薄层分离条件经适当改变，转至一般柱色谱所采用洗脱的方式进行制备柱分离。薄层色谱法亦应用于中草药品种、药材及其制剂真伪的检查、质量控制和资源调查，对控制化学反应的进程、反应副产品产物的检查、中间体分析、化学药品及制剂杂质的检查，临床和生化检验以及毒物分析等，都是有效的手段。

（三）气相色谱法

气相色谱法是在以适当的固定相做成的柱管内，利用气体（载气）作为移动相，使试样（气体、液体或固体）在气体状态下展开。在色谱柱内分离后，各种成分先后进入检测器，用记录仪记录色谱图。在对装置进行调试后，按各单体的规定条件调整柱管、检测器、温度和载气流量。进样口温度一般应高于柱温30～50℃。如用火焰电离检测器，其温度应等于或高于柱温，但不得低于100℃，以免水汽凝结。色谱上分析成分的峰的位置，以滞留时间（从注入试样液到出现成分最高峰的时间）和滞留容量（滞留时间×载气流量）来表示。这些在一定条件下能反映出物质所具有特殊值，并据此确定试样成分。

根据色谱上出现的物质成分的峰面积或峰高进行定量。峰面积可用面积测定仪测定，按半宽度法求得（即以峰1/2处的峰宽×峰高求得）。峰高的测定方法是从峰高的顶点向记录纸横坐标作垂线，找出此垂线与峰的两下端联结线的交点，即以此交点至峰顶点的距离长度为峰高。

定量方法可分以下3种：

1.内标准法

取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调制标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱，根据色谱图，取标准被测成分的峰面积和峰高与内标物质的峰面积和峰高之比为纵坐标，取标准被测成分量和内标物质量之比（或标准被测成分量）为横坐标，制成标准曲线。

然后按单体中所规定的方法调制试样液。在调制试样液时，预先加入与调制标准液时等量的内标物质。然后按制作标准曲线时的同样条件下得出的色谱，求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高之比，再按标准曲线求出被测成分的含量。

所用的内标物质，应采用其峰面积的位置与被测成分的峰的位置尽可能接近并与被测成分以外的峰位置完全分离的稳定的物质。

2.绝对标准曲线法

取标准被测成分，按依次增加或减少阶段法，各自调制成标准液，注入一定量后，按色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高为纵坐标，而以标准被测成分的含量为横坐标，制成标准曲线。然后按单体中所规定的方法制备试样液。取试样液按制标准曲线时相同的条件作出色谱，求出被测成分的峰面积和峰高，再按标准曲线求出被测成分的含量。

3.峰面积百分率法

以色谱中所得各种成分的峰面积的总和为100，按各成分的峰面积总和之比，求出各成分的组成比率。

（四）高效液相色谱法

高效液相色谱法是一种多用途的色谱方法，可以使用多种固定相和流动相，并可以根据特定类型分子的大小、极性、可溶性或吸收特性的不同将其分离开来。高效液相色谱仪一般由溶剂槽、高压泵（有一元、二元、四元等多种类型）、色谱柱、进样器（手动或自动）、检测器（常见的有紫外检测器、折光检测器、荧光检测器等）、数据处理机或色谱工作站等组成。

其核心部件是耐高压的色谱柱。HPLC柱通常由不锈钢制成，并且所有的组成元件、阀门等都是由可耐高压的材料制成。溶剂运送系统的选择取决于：①等度（无梯度）分离，在整个分析过程中只使用一种溶剂（或混合溶剂）；②梯度洗脱分离，使用一种微处理机控制的梯度程序来改变流动相的组分，该程序可通过混合适量的两种不同物质来产生所需要的梯度。

由于HPLC的高速、灵敏和多用途等优点，它成为许多生物小分子分离所选择的方法，常用的是反相分配色谱法。大分子物质（尤其是蛋白质和核酸）的分离通常需要一种“生物适合性”的系统如Pharmacia FPLC系统。在这类色谱中用钛、玻璃或氟化塑料代替不锈钢组件，并且使用较低的压力以避免其生物活性的丧失。这类分离用离子交换色谱、凝胶渗透色谱或疏水色谱等方法来完成。

第四节　化合物纯度的判定

化合物纯度的鉴定方法，从快速、便宜、简便的要求出发，主要来自于以下几点：

一、通过TLC的纯度的鉴定

①展开溶剂的选择，至少需要3种不同极性展开系统展开，首先要选择三种分子间作用力不同的溶剂系统，如氯仿/甲醇、环己烷/乙酸乙酯、正丁醇/乙酸/水，分别展开来确定组分是否为单一斑点。这样做的好处是很明显的，通过组分间的各种差别将组分分开，有可能几个相似组分在一种溶剂系统中是单一斑点，因为该溶剂系统与这几个组分的分子间力作用无显著的差别，不足以在TLC区分；而换了分子间作用力不同的另一溶剂系统，就有可能分开。

②对于一种溶剂系统至少需要3种不同极性展开系统展开，一种极性的展开系统将目标组分的Rf推至0.5，另两种极性的展开系统将目标组分的Rf推至0.8、0.2。其作用是检查有没有极性比目标组分更大或更小的杂质。

③显色方法，光展开是不够的，还要用各种显色方法。一般一定要使用通用型显色剂，如10％硫酸、碘，因为每种显色剂（不论是通用型显色剂，还是专属显色剂）在工作中都会遇到有一化合物不显色的时候，再根据组分可能含有混杂组分的情况，选用专属显色剂。只有在多个显色剂下均为单一斑点，这时才能下结论样品为薄层纯。

二、通过熔程判断纯度

纯净物，熔程很短；混合物熔点下降，熔程变长。

三、基于HPLC的纯度鉴定

对于HPLC因为常用的系统较少，加之其分离效果好，我们一般不要求选择三种分子间作用力不同的溶剂系统，只要求选这三种不同极性的溶剂系统，使目标峰在不同的保留时间出峰。

四、基于软电离质谱的纯度鉴定

如ESI-MS、APCI-MS。大极性化合物选用ESI-MS，极性很小的化合物选用APCI-MS。这些软电离质谱的特点是只给出化合物的准分子离子峰，通过正负离子的相互沟通来确定相对分子质量。如果样品不纯，就会检出多对准分子离子峰，不但确定了纯度，还能明确混杂物的相对分子质量。

五、基于核磁共振的纯度鉴定

从氢谱中如果发现有很多积分不到1的小峰，就有可能是样品是样品中的杂质。利用门控去偶的技术通过对碳谱的定量也能实现纯度鉴定。

对化合物纯度的要求，世界上不存在100％纯的化合物。纯度应该与实验的目的有关。例如，想测核磁共振鉴定结构，一般要求95％的纯度；如果想测EI-MS，纯度越高越好，99％以上。

但是以上的方法都不能区分对映异构体。